临床分子诊断及测序方法概述

分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域，主要系利用分子生物学技术检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化，从而为疾病的预防、诊断、治疗和预后提供决策信息。临床分子诊断常用技术主要包括荧光原位杂交、PCR（聚合酶链式反应）和基因测序等；与传统生化和免疫诊断相比，其能够在基因水平上实现更高灵敏度、更强特异性与更早检测窗口。

临床分子诊断不同技术路径比较

注：免疫组化虽非严格意义上的分子诊断技术，但其可通过检测 4 种 DNA 错配修复蛋白的表达缺失情况来间接评估 MSI 状态，故在此一并纳入比较

数据来源：根据公开资料整理

基因是携带特定遗传信息的 DNA 片段，系遗传物质的基本物理和功能单位。基因通过编码并指导合成生物个体所需的 RNA 和蛋白质分子来调控其生长发育过程及性状。基因测序旨在确定基因组中 DNA 片段的碱基排列顺序。经过数十年发展，基因测序技术已经从早期成本高昂、效率低下的 Sanger 测序技术发展至高通量测序技术。

Sanger 测序，即双脱氧核苷酸末端终止法测序，始于 20 世纪 70 年代，其原理是在体外 DNA 复制过程中选择性掺入可导致链合成反应终止的双脱氧核苷酸，通过电泳分离获得一系列长度不同的 DNA 片段，进而推导出完整核苷酸序列。

Sanger 测序技术在人类基因组计划 DNA 测序后期阶段发挥了关键作用，加速了 人 类 基 因 组 计 划 的 完 成 。 历 经 约五 十 年的 发 展 与 完 善 ， 目前 可对 长 达1,000bp 的 DNA 片段进行测序，单个碱基读取准确率高达 99.99%，是验证特定基因序列的金标准。但 Sanger 测序存在较大局限性，突出表现为单个反应仅可对一个 DNA 片段（约 500-1,000bp）进行测序，通量与效率较低，在长 DNA 片段和预期区域之外的序列测序中受到较大限制；

同时检测灵敏度偏低，难以可靠检出正常核酸中混有的低丰度基因突变。此外，Sanger 测序成本高昂，历史上 1Mb 的测序费用约为 500 美元，完成单个人类基因组全测序的成本约为 150万美元。总体而言，Sanger 测序技术在效率和成本方面都已接近极限，迫切需要通量更高、成本更低的全新基因测序技术。

高通 量 测 序 技 术 又 称 第 二 代 或 下 一 代 测 序 技 术 （Next-GenerationSequencing，NGS），采用平行测序理念，是继 Sanger 测序之后的革命性进步，其典型核心原理是边合成边测序。

具体而言，将待测序列片段化及变性处理后，根据不同测序平台，采用固相桥式扩增、液相滚环扩增等方式将单一分子扩增至克隆簇并锚定于固相表面；在对上述每个待测序簇进行延伸互补时，掺入经荧光标记的核苷酸或探针，经激发产生特征荧光；通过捕捉荧光信号完成碱基识别获取待测片段序列信息，再使用生物信息学工具对所有片段信息进行分析，进而最终拼接得到完整基因图谱。高通量测序技术可以同时对数百万条甚至更多的 DNA 进行测序，从而以较低的成本实现了极高的通量和速度；过去使用Sanger 测序技术耗时多年的基因组测序项目，如今仅需几天即可完成。

除上述以外，近年来兴起的单分子实时测序技术和纳米孔测序技术，其主要通过现代光学、高分子、纳米技术等手段区分碱基信号差异，无需扩增即可实现更长的序列读取。尽管该类测序技术理论上具有更长读长和无需扩增的优势，但其单次单分子测序（单条读取）错误率高达 15%，虽可通过多次测序提升准确度，但会显著增加检测成本，进而导致单位测序成本明显高于高通量测序技术，目前尚未大规模应用于临床。

总之，随着人们对疾病分子机理认识的不断深入以及测序技术的持续发展与完善，高通量基因测序可以一次性检出多种复杂基因变异类型，被广泛应用于生命科学研究与临床分子诊断，其中尤以肿瘤精准医疗领域最为令人瞩目。