2小时出结果！新型CRISPR微流控平台实现MRSA血流感染床旁诊断

细菌血流感染及其继发的脓毒症、脓毒性休克，是危重症患者死亡的主要原因，抗菌药物耐药与抗生素不合理使用使这一局面持续恶化。金黄色葡萄球菌是临床高危致病菌，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），会进一步推高患者死亡风险。对于这类感染，及时检出病原菌并开展靶向抗菌干预，是改善患者预后的核心。

作为诊断金标准的血培养耗时长、操作繁琐，往往延误精准治疗的时机。现有的多种免培养分子检测技术，又受限于成本、样本前处理复杂等因素，很难直接用于床旁快速筛查。CRISPR-Cas技术给快速病原检测带来新思路，但现有检测方案大多无法直接处理全血样本，难以满足临床实际需求。

近日，Smart Laboratory Diagnostics 编委、上海交通大学医学院附属仁济医院汪骅教授，联合上海交通大学医学院附属仁济医院李敏教授、重庆市急救医疗中心（重庆大学附属中心医院）李维教授团队，上海市公共卫生临床中心李顺教授，提出了一种基于鱼骨结构微流控芯片的CRISPR检测平台HELP，可在全血中免培养完成金黄色葡萄球菌富集、裂解与nucA、mecA双基因检测，实现约2小时完成MRSA检测。该研究发表在ACS Sensors（IF：10.9）。

文章链接：

引用格式：

Huang H Q, Zhang J H, Hu X F, et al. CRISPR‑Based Diagnostic Assay for Point-of-Care Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in patients with Bloodstream Infections[J]. ACS Sensors, 2026.

一步法 RPA-CRISPR检测体系的建立与性能验证

为实现MRSA的分子识别，研究团队构建了一套单管一步法RPA-CRISPR/Cas13a检测体系，采用双靶标策略同步实现菌种鉴定与耐药判定。nucA基因为金黄色葡萄球菌的物种特异性基因，用于病原菌的种类识别；mecA基因是介导甲氧西林耐药的核心基因，用于MRSA阳性判定。

整套反应可在37℃恒温条件下30 min内完成。当样本中存在靶标基因时，首先通过重组酶聚合酶扩增技术对痕量靶标DNA进行指数级扩增，扩增产物经T7 RNA聚合酶转录生成RNA后，可与特异crRNA结合并激活Cas13a蛋白的反式切割活性，通过非特异性切割荧光标记的报告探针，使荧光基团与淬灭基团相互分离，进而产生可被读取的荧光信号。

研究团队针对crRNA与扩增引物开展了系统的筛选与优化，得到最优工作序列与引物组合，测序验证扩增产物特异性。体系性能评价结果显示，该检测体系特异性良好，可区分MRSA、甲氧西林敏感金葡菌以及其他对照致病菌；两个靶标的检测下限均可达到10 拷贝/反应，具备识别低丰度靶核酸的能力。

▲ 一锅法RPA-CRISPR系统的优化与验证

鱼骨结构微流控芯片的设计与前处理体系优化

试管水平建立的RPA-CRISPR体系虽已具备良好分子性能，但无法耐受全血复杂基质，血液中各类干扰组分易造成检测失效。为实现全血样本直接检测，研究团队设计了集成化鱼骨结构微流控芯片，芯片整体分为两大功能模块，中间通过塑料螺丝阀实现物理分隔，有效避免检测区交叉污染，保障结果准确性。

上游为细菌捕获-裂解-核酸释放区，设置样本入口与废液出口；下游为双基因检测区，分为nucA和mecA两个独立反应腔，预装冻干的RPA-CRISPR试剂，纯化后的核酸流入后即可启动反应。样本前处理阶段螺丝阀保持关闭，废液从上游出口排出；核酸释放完成后封闭出口、打开阀门，核酸溶液流入下游检测区启动后续反应。

▲ 鱼骨结构芯片特性分析

芯片捕获区的鱼骨结构微通道结构可破坏流体层流状态诱导微涡流，强化细菌与磁珠的碰撞结合效率；芯片表面固定万古霉素修饰的磁性纳米颗粒，可通过识别细菌细胞壁肽聚糖的D -丙氨酸末端，特异性捕获全血中的金黄色葡萄球菌。流体仿真验证了鱼骨结构通道内微涡流的形成，实验对比结果显示，相比常规结构微流控芯片与试管法，鱼骨结构芯片的细菌捕获效率显著提升，且重复性更好，大幅降低了手工操作带来的误差。

研究同时系统优化了芯片前处理的关键参数，样本流速、万古霉素磁珠浓度、血液稀释比例、裂解孵育时间均得到最优取值，在保证捕获与提取效率的同时，兼顾了操作便捷性，适配床旁检测的需求。

▲ 芯片式细菌捕获与DNA提取技术的建立与优化

HELP集成检测系统的构建与分析性能

在获得性能可靠的分子反应体系与芯片前处理方案之后，需要将二者与便携式检测硬件整合，组装为完整的检测设备，利用模拟全血样本评估整套集成系统的实际检测能力。

研究将鱼骨结构微流控芯片、便携式无线荧光分析仪与配套智能手机小程序集成为HELP完整检测平台，建立标准化的操作流程，实现一体化“样本进-结果出”的检测模式。

研究采用向无菌全血中添加金黄色葡萄球菌的方式制备模拟感染样本，对整机的灵敏度与特异性开展测试。模拟样本测试结果显示，该平台检测灵敏度可达1 CFU/mL，并且仅对金黄色葡萄球菌产生阳性信号，整机在全血基质条件下依然保持良好的检测特异性。

▲ HELP系统检测时效优势

临床验证与临床应用价值

为验证该平台的临床应用价值，研究共纳入350例疑似血流感染住院患者，开展前瞻性多中心临床评估。

结果显示，研究纳入的350 份疑似血流感染住院患者样本中共检出20例金黄色葡萄球菌阳性，其中8例为 MRSA，HELP平台的检测结果与血培养这一临床诊断金标准高度一致。与液滴数字PCR（ddPCR）开展头对头方法学比较表明：ddPCR需依赖血清分离步骤，该前处理过程易导致低载量病原菌丢失，从而引发假阴性结果；而HELP平台可直接以全血为检测样本，无需离心分离血清，在真实世界临床样本中展现出更高的检测灵敏度与临床符合率。

研究同时横向对比了HELP与主流检测方法的综合性能，HELP在检测时长与检测成本方面具备明显优势。

▲ HELP系统临床应用分析

总结

该研究打通了从生化反应、微流控样本前处理到便携式终端的完整技术链条，证实微流控与CRISPR等温扩增结合，可克服全血样本基质干扰，实现免培养的床旁病原-耐药同步检测。

相较于传统分子手段大多需要单独核酸提取的操作模式，HELP把细菌富集、裂解、核酸纯化集成在单块芯片内部，降低了人为操作带来的污染与误差。该工作为耐药菌血流感染POCT设备研发提供了可行范式；后续拓展靶标，可覆盖革兰阴性菌和真菌等常见致病菌。

专家简介

汪骅教授

，医学博士，主任技师，博士生导师。入选2024年度上海市“东方英才计划”拔尖人才；获2025年上海市医学科技奖一等奖；获2025年“春昇杯”医学创新人才大赛优胜奖及首届上海“国投孚腾杯”临床创新创业大赛银奖。长期聚焦临床检验领域的医教研协同发展，秉持“临床问题驱动”研究理念，致力于微流控技术与分子即时检测的临床转化研究。迄今主持国家自然科学基金面上项目、上海市科委及教委重点/面上项目、上海交通大学医工交叉重点专项等各级科研课题16项；以第一作者或通讯作者在ACS Nano、Advanced science、Biosensors & Bioelectronics、Clinical Chemistry等国际权威期刊发表SCI论文40余篇；获国家发明专利授权12项，其中2项已实现产业化转化。